响应面法优化提取茼蒿中多酚类物质
王凤娟, 孙飞龙, 张冬梅, 唐薇     
西安工程大学 环境与化学工程学院, 陕西 西安 710048
摘要: 为优化超声辅助提取茼蒿中多酚类物质的工艺条件,在单因素实验基础上,采用Box-Behnken中心组合试验和响应面法优化超声辅助提取茼蒿中多酚的工艺条件.超声辅助提取茼蒿多酚的最佳工艺条件为液固比12:1(mL/g)、乙醇体积分数70%、超声时间45 min,多酚得率3.03%,与响应曲面拟合所得方程的预测值3.08%符合良好,此模型合理可靠,可用于多酚提取的实际预测.
关键词: 草本植物茼蒿     生物活性物质多酚     超声提取     响应面法    
Optimization of extraction process of polyphenols from chrysanthemum coronarium by response surface methodology
WANG Fengjuan, SUN Feilong, ZHANG Dongmei, TANG Wei     
School of Environmental and Chemical Engineering, Xi'an Polytechnic University, Xi'an 710048, China
Abstract: In order to optimize the ultrasonic-assisted extraction process of polyphenols from Chrysanthemum coronarium, based on single factor experiment, Box-Behnken experimental design and response surface method were employed to optimize the ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenols from Chrysanthemum coronarium.The optimum ultrasonic-assisted extraction technological condition of chrysanthemum polyphenols for liquid solid ratio is 12:1 (mL/g), ethanol volume fraction 70%, ultrasonic time 45 min, polyphenols yield 3.03%.This result and response surface fitting equations obtained for the prediction of values 3.08% are in good agreement. Therefore, this model is reasonable and reliable, and can be used in practical forecasting of polyphenols extraction.
Key words: herbs chrysanthemum    bioactive substances polyphenols    ultrasonic extraction    response surface methodology    
0 引言

茼蒿(Chrysanthemum Coronarium)又称同蒿, 属菊科, 是一年生或两年生草本植物[1].茼蒿具有镇咳祛痰、植物化感作用、抗肿瘤、杀线虫、抗氧化和清除自由基、护肝和抗菌等[2]多种生物活性.黄酮和酚类成分是茼蒿发挥植物化感作用和抗氧化作用的物质基础.李昊阳等[3]研究表明, 多酚具有很强的抗氧化作用, 可以作为一种天然的抗氧化剂, 因此具有较高的研究价值.目前, 植物多酚的提取实验中所用浸提液大多为水、醇类、酮类, 但酮类具有毒性且易燃易爆, 所以多采用水提和醇提的方法[4].随着科学技术的发展, 实验大多采用超声辅助、微波辅助等技术.大量研究表明, 新型的提取方法与传统的提取方法相比, 提取时间缩短, 提取率增加, 产品质量提高[5-7].本文利用超声波辅助提取工艺, 通过液固比、乙醇体积分数、超声时间等单因素实验确定提取条件, 采用响应面优化方法对其提取条件进行优化,从茼蒿中提取生物活性物质多酚.

1 实验 1.1 材料与仪器 1.1.1 材料

市售新鲜茼蒿焦性没食子酸(天津市科密欧化学试剂有限公司, 分析纯); Foline-phenol(上海金穗生物科技有限公司,分析纯); 无水乙醇(天津市津东天正精细化学试剂厂,分析纯); 无水碳酸钠(天津市津东天正精细化学试剂厂,分析纯); 蒸馏水(实验室自制).

1.1.2 仪器

SK5200LH超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司); 三用电热恒温水箱(天津市泰斯特仪器有限公司); 722型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司); DGF-1AB型立式电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司); 高速多功能粉碎机(上海罗兰德工贸有限公司); 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司); SHZ-D循环水式真空泵(巩义市英裕予华仪器厂).

1.2 实验方法 1.2.1 提取工艺流程

首先将购于陕西省西安市市场的新鲜茼蒿, 置于60 ℃电热鼓风干燥箱干燥24 h后, 粉碎, 过60目筛, 密封装袋, 备用; 具体提取工艺流程为:新鲜茼蒿→洗净→烘干→粉碎→浸提→超声处理→冷却→抽滤→滤液→测吸光值.

1.2.2 没食子酸标准曲线的制作

称取0.05 g没食子酸标品, 用蒸馏水溶解并定容于100 mL容量瓶中, 得到质量浓度为500 μg/mL的对照品标准溶液.移取该溶液0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 mL置于10 mL比色管中, 定容摇匀, 配成一系列不同质量浓度的标准溶液.然后从各溶液中吸取1 mL加入25 mL容量瓶内, 先加入10 mL蒸馏水, 摇匀, 再加入1.5 mL Folin-Ciocalteu试剂[8], 并充分摇匀, 在0.5~8 min内加入6 mL 10% Na2CO3溶液, 混匀, 加水定容,再混匀.在30 ℃下避光反应2 h后, 在760 nm处测定吸光度.实验设空白对照, 以去离子水代替标准溶液.实验重复3次, 以没食子酸浓度为横坐标, 以平均吸光度值为纵坐标, 得到一元线性回归方程:Y=0.006 5X+0.025, R2=0.998 5.其中, X为没食子酸标准溶液质量浓度(μg/mL); Y为没食子酸标准溶液吸光值.实验结果表明, 没食子酸标准品溶液质量浓度在(25~200) μg/mL范围内线性关系良好.

1.2.3 提取液中总多酚类含量的测定

移取待测提取液1 mL于25 mL容量瓶中, 定容,从溶液中吸取1 mL待测液加入25 mL容量瓶内, 先加入10 mL蒸馏水, 摇匀, 再加入1.5 mL Folin-Ciocalteu试剂, 充分摇匀.在0.5~8 min内加入6 mL 10% Na2CO3溶液, 混匀.加水定容, 再混匀, 在30 ℃下避光放置反应2 h, 以0样为空白, 在760 nm处测定吸光度[9].由回归方程得到茼蒿提取液中多酚质量浓度, 计算提取液中多酚质量, 并按Y1=m1/m0计算茼蒿中多酚提取量.其中,m0为提取液中多酚的质量(mg); m1为多酚提取量(mg/g); Y1为茼蒿的质量(g).按照标准回归方程计算茼蒿中多酚类化合物的多酚得率:

$多酚得率 = \frac{{\left( {A - 0.025} \right) \times 50 \times {{10}^{ - 6}} \times v}}{{0.0065}} \times 100\% .$

式中:A为在760 nm处测定的吸光值,50为多酚化合物稀释倍数,v为液体体积,10-6为μg和g之间的换算单位.

1.3 多酚类物质提取的单因素实验

在高温下多酚结构易遭到破坏, 造成提取率下降, 实验过程中应控制变量, 温度保持在30 ℃.

1.3.1 液固比的确定

取1.00 g预处理后的原材料于50 mL三角瓶中, 按液固比(mL/g)5:1,10:1,15:1,20:1,25:1,30:1与体积分数为60%的乙醇混匀.在200 W,40 kHz条件下避光超声30 min, 抽滤提取液, 冷却, 将滤液转至25 mL烧杯中, 依据1.2.3的方法分析不同液固比对茼蒿中多酚提取率的影响.

1.3.2 乙醇体积分数的确定

依据1.3.1的方法, 液固比(mL/g) 10:1, 超声30 min, 分析乙醇体积分数为30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%对茼蒿中多酚提取率的影响.

1.3.3 超声时间的确定

依据1.3.1的方法, 液固比(mL/g) 10:1, 乙醇体积分数为60%, 分析超声时间20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min, 70 min对茼蒿中多酚提取率的影响.

1.4 响应面法优化茼蒿中多酚的提取条件

根据单因素实验对液固比、乙醇体积分数、超声时间进行三因素三水平响应面分析, 根据Box-Behnken Design(BBD)设计响应面实验, 分析茼蒿多酚在不同提取条件下的含量, 从而优化最佳提取条件[10].中心组合Box-Behnken因素水平见表 1.

表 1 中心组合Box-Behnken因素水平表 Table 1 Table of center combination Box-Behnken factors level
因素水平
-101
液固比A/(mL·g-1)51015
乙醇体积分数B/%607080
超声时间C/min304050
1.5 实验验证

以茼蒿为材料, 按照Design Expert软件中的Box-Behnken Design模型得到优化的提取条件, 设计三组平行实验, 按照福林酚法测定提取液中的多酚含量, 并计算相对标准偏差(RSD).

2 结果与讨论 2.1 液固比对茼蒿多酚提取率的影响

不同液固比对茼蒿中多酚提取率的影响不同, 测定结果如图 1所示, 从图 1可以看出, 初始时, 液固比的增加导致多酚提取率也随之增加, 当液固比为10:1时, 多酚提取率达到最大, 继续增加液固比多酚提取率反而降低, 因为多酚的溶解度的提取温度是一定的, 因此随着提取溶剂体积的增加,多酚的溶解量也增加, 当乙醇体积达到某一值时, 多酚不再溶解, 此时再增加溶剂,体积不仅增加成本, 而且使其杂质含量增加, 故选择液固比为10:1左右为宜[11].

图 1 液固比对茼蒿多酚提取率的影响 Figure 1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of polyphenols from Chrysanthemum
2.2 乙醇体积分数对茼蒿多酚提取率的影响

不同乙醇体积分数对茼蒿多酚提取率的影响不同, 测定结果如图 2所示, 从图 2可以看出, 随着乙醇体积分数的增加导致多酚得率也随之增大, 当乙醇体积分数为70%时, 多酚提取率达到最大, 之后多酚提取率随着乙醇体积分数的增加反而降低.因为多酚类物质在乙醇溶液中的溶解度随着乙醇体积分数的增加而增加, 当乙醇体积分数达到70%后, 溶液极性增强, 导致多酚类物质的溶解度下降, 故乙醇体积分数应确定在70%左右.

图 2 乙醇体积分数对茼蒿多酚提取率的影响 Figure 2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of polyphenols from Chrysanthemum
2.3 超声时间对茼蒿多酚提取率的影响

不同超声时间对茼蒿多酚提取率的影响如图 3所示.从图 3可以看出, 超声时间越长, 提取率越高, 40 min时到达最高, 之后有所下降.由于超声波具有较强的剪切作用, 长时间作用会破坏多酚的分子结构, 使得多酚得率出现下降趋势,因此选择超声时间在40 min左右.

图 3 超声提取时间对茼蒿多酚提取率的影响 Figure 3 Effect of extraction time on the yield of polyphenols from Chrysanthemum
2.4 响应面分析因素水平的选取

根据Box-Behnken中心组合实验设计原理, 并结合上述单因素影响的实验结果, 选取液固比(A)、乙醇体积分数(B)和超声时间(C)3个影响因素, 在单因素实验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法, 共17个实验点, 响应面实验设计及结果见表 2.

表 2 响应面实验设计及结果 Table 2 Response surface experimental design and results
实验号ABCY/%
10-1-11.97
2-1-102.20
30-112.68
40003.03
5-1102.41
61012.89
710-12.29
80003.04
90002.95
10-10-12.10
111102.67
120002.95
1301-12.15
140003.01
150112.62
161-102.62
17-1012.56
2.5 数学模型的建立

利用Design-Expert 8.05b软件对表 2实验数据进行方差分析和多元回归拟合, 结果见表 3.拟合的多元回归方程为Y=3.00+0.15A+0.048B+0.28C-0.040AB+0.035AC-0.060BC-0.21A2-0.31B2-0.33C2, 其中,Y为多酚提取率.

表 3 回归模型方差分析 Table 3 Variance analysis of regression model
方差来源平方和自由度均方FP
模型2.029
A0.1810.22
B0.01810.18104.73<0.000 1
C0.6310.01884.17<0.000 1
AB6.400×10-310.638.440.022 8
AC4.900×10-316.400×10-3293.28<0.000 1
BC0.01414.900×10-32.990.127 3
A20.1810.0142.290.173 9
B20.4110.186.730.035 7
C20.4510.4185.16<0.000 1
残差0.01570.45192.89<0.000 1
失拟值7.450×10-332.139×10-3211.82<0.000 1
纯误差2.483×10-342.483×10-31.320.384 4
总回归2.0316
注:差异高度显著P<0.01;差异显著P<0.05

表 3可以看出, 整体模型显著性水平P<0.000 1, 表明二次方程模型达到极度显著水平; 同时失拟项P=0.384 4>0.05, 表明差异不显著, 残差均由随机误差引起, 建模成功; 回归方程相关系数(R2=0.992 6, Adj-R2=0.983 2, Pred-R2=0.935 5) 及变异系数CV(1.78%)均表明模型方程能够较好地反映真实的实验值.因此, 可以用该模型对实验结果进行分析及预测.从表 4可以看出, 液固比、超声时间的一次项、二次项, 以及乙醇体积分数和超声时间的交互项, 对响应值的影响都达到极显著水平(P<0.01), 而乙醇体积分数达到显著水平(P<0.05), 说明响应值的变化较复杂, 各个试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系, 而应呈二次抛物面关系.从各变量显著性检验P的大小, 可以得出所研究各因素对茼蒿中多酚提取效果影响大小顺序:液固比>超声时间>乙醇体积分数.

2.6 响应面分析

绘制各影响因素对茼蒿中多酚提取率的响应曲面图如图 4~6所示.利用Design Expert 8.05b软件, 绘制各影响因素对茼蒿中多酚提取率的响应曲面图, 考察所拟合的响应面的形状, 分析液固比(A)、乙醇体积分数(B)和超声时间(C)对茼蒿多酚含量的影响.响应曲面坡度越平缓, 其可以抵抗外在条件的变化能力越强, 响应值的大小变化越小;相反, 响应曲面坡度越陡, 响应值变化越大[12].比较图 4~6各个曲面图可知, 液固比A对茼蒿中多酚提取率的影响最为显著, 曲线较陡, 而乙醇体积分数B和超声时间C次之, 曲线较为平稳, 乙醇体积分数的影响最小, 结果与方差分析相似.

图 4 液固比和乙醇体积对多酚提取影响的响应面图 Figure 4 Response surface diagram of the effect of liquid solid ratio and ethanol volume on polyphenol extraction
图 5 液固比和超声时间对多酚提取影响的响应面图 Figure 5 Response surface diagram of liquid solid ratio and ultrasonic time on polyphenol extraction
图 6 乙醇体积分数和超声时间对多酚提取影响的响应面图 Figure 6 Response surface diagram of ethanol volume fraction and ultrasonic time on polyphenol extraction
2.7 茼蒿中多酚提取最优工艺及其验证

从回归模型可知, 最佳提取条件为液固比12.02:1(mL/g),乙醇体积分数70.06%,超声时间44.50 min, 茼蒿中多酚类物质得率的理论值为3.08%.为了操作方便, 将上述条件修正为液固比12:1,乙醇体积分数70%,超声时间45 min.在此修正条件下进行3次平行验证实验.茼蒿总多酚得率为3.03%, RSD为0.82%, 与理论预测值(3.08%)相比误差为0.05%.因此, 利用响应面法优化得到的提取条件参数准确可靠.

3 结论

(1) 拟合的多元回归方程的相关系数及变异系数均表明,模型方程能够较好地反映真实的实验值.在所选因素水平内, 液固比、超声时间对多酚提取率有极显著影响, 乙醇体积分数影响显著.回归方程的一次项和二次项达到显著水平, 各因子对响应值的影响呈二次抛物面关系, 可以利用此回归模型确定提取工艺的最佳条件范围.3个因素中影响大小的顺序:液固比>超声时间>乙醇体积分数.

(2) 茼蒿多酚的最佳提取工艺条件:液固比12:1(mL/g),乙醇体积分数70%,超声时间45 min.在此条件下做3次平行实验, 茼蒿多酚平均得率为3.03%, RSD为0.82%, 预测值为3.08%.

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西安工程大学主办。
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王凤娟, 孙飞龙, 张冬梅, 唐薇
WANG Fengjuan, SUN Feilong, ZHANG Dongmei, TANG Wei
响应面法优化提取茼蒿中多酚类物质
Optimization of extraction process of polyphenols from chrysanthemum coronarium by response surface methodology
西安工程大学学报, 2017, 31(4): 480-485
Journal of Xi′an Polytechnic University, 2017, 31(4): 480-485

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收稿日期: 2017-03-27

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